培養細胞やプロトプラストを利用した transient assay 系で蛋白の発現を確認する方法についての情報です。
【Thu, 27 Feb 2003 21:39:57】
[nazuna 01835] Transient assay の際のタンパク質発現量—————
私たちのところではイネ Oc 細胞のプロトプラストでトランジエントに発現させたエピトープタグ付きの転写因子やプロテインキナーゼをウェスタンで検出しています。かなり強いプロモーターを使っていることもありますが、結構楽に検出可能です。抗体の善し悪しにも依存すると思いますが、市販の抗 HA 抗体を使う限りはうまくいっています。
【Fri, 28 Feb 2003 09:38:59】
[nazuna 01837] Transient assay の際のタンパク質発現量—————
うちのラボでは、シロイヌナズナの培養細胞に PEG 法で、35S プロモーターを用いて myc-epitope をつけた、SNARE タンパク質をトランジェントで発現させて、myc 抗体を 用いてウェスタンを行っています。ECL で検出していますが、発現条件がいい場合には、容易にタンパク質を検出することができます。目的のタンパク質の発現量にもよると思いますが、よい抗体を使えば、発現をトランジェントで解析するのはそんなに難しいことではないと思います。
【Tue, 04 Mar 2003 13:57:00】
[nazuna 01839] Transient assay の際のタンパク質発現量—————
ウチの研究室では myc 抗体と T7 抗体を利用していますが、問題なくウエスタンで検出できてますよ。培養細胞はアラビです。形質転換効率は 10-50% くらいでしょうか。
私もタバコ BY-2 細胞、ナズナ培養細胞由来のプロトプラストで発現させたタンパクをウエスタンで確認しましたが、問題なく検出できました。かなり発現の弱い own promoter を発現に用いたので検出できるか疑わしかったのですが、私どもが使っている系では十分な発現が得られたようです。大切なのは抗体の力価であると思われます。私が用いたのは市販の c-Myc 抗体なので、力価のもっと低いものを用いた場合は問題が生じるかもしれません。
